簡要描述：外泌體膜含有分泌細(xì)胞來源蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，其中，磷脂酰s氨酸（PS），目前普遍認(rèn)為在活細(xì)胞中通過脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶的作用定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但是，它也暴露在外泌體膜的外側(cè)3）。Tim4（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4）是凋亡細(xì)胞的巨噬細(xì)胞吞噬受體。在鈣離子存在下，Tim4通過與胞外區(qū)的IgV結(jié)構(gòu)域結(jié)合到PS 4
產(chǎn)品型號
廠商性質(zhì)
更新時間
瀏覽次數(shù)
產(chǎn)品分類
| 品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 一個月 |
|---|
使用磷脂酰si氨酸和Tim4的新型外泌體純化法：PS親和法
外泌體膜含有分泌細(xì)胞來源蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，其中，磷脂酰si氨酸（PS），目前普遍認(rèn)為在活細(xì)胞中通過脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶的作用定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但是，它也暴露在外泌體膜的外側(cè)3）。Tim4（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4）是凋亡細(xì)胞的巨噬細(xì)胞吞噬受體。在鈣離子存在下，Tim4通過與胞外區(qū)的IgV結(jié)構(gòu)域結(jié)合到PS 4）。
以上述知識作為參考，我們利用Tim4固化磁珠，在鈣離子存在下捕獲培養(yǎng)上清和血清等樣品中的外泌體，并通過添加螯合劑即可純化外泌體，這種劃時代的外泌體純化方法是由FUJIFILM Wako和金澤大學(xué)納米生命科學(xué)研究所的華山教授共同開發(fā)并取得了成功5）。
與傳統(tǒng)的外泌體純化法相比，外泌體純化試劑盒“MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2"可實現(xiàn)更加簡單地純化完整狀態(tài)的高純度外泌體。這是可取代迄今為止的黃金標(biāo)準(zhǔn)法超速離心法的新型外泌體純化法。
利用磷脂酰si氨酸（PS）結(jié)合分子以金屬離子依賴性方式捕獲細(xì)胞外囊泡，并通過螯合劑洗脫。
◆利用PS親和法提取和分離細(xì)胞外囊泡（外泌體）
采用新型親和純化法 ● 使用PS親和分子回收※ ● 低背景 ● 在中性條件下利用螯合劑溫和洗脫
分離高純度完整的外泌體 | 無需進(jìn)行超速離心 ● 使用磁珠提高操作性 ● 優(yōu)化實驗protocol
實驗再現(xiàn)性高 |
和其他純化方法的比較
方法 | 純度 | 外泌體回收量 | 獲得完整粒子 | 總蛋白量 |
MagCapture™（PS親和法） | ■ ■ ■ ■ | ■ ■ ■ | ○ | ■ |
超速離心法 | ■ ■ | ■ ■ | ○ | ■ ■ ■ |
聚合物沉淀法 | ■ | ■ ■ | ○ | ■ ■ ■ ■ |
密度梯度離心法 | ■ ■ ■ | ■ | ○ | ■ ■ |
尺寸排阻法 | ■ ■ ■ | ■ ■ | ○ | ■ ■ |
表面抗原親和法 (使用抗體) | ■ ■ ■ | ■ ■ | × | No data |
※ 本表格根據(jù)FUJIFILM Wako自行調(diào)查的結(jié)果制成。表中結(jié)果可能因樣品、檢測對象與方法的不同而有所差異,無法保證以上各方法的性能。
◆MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2
MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS Ver.2：PS親和法x磁珠
該試劑盒可從細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿等樣品中高純度且簡便快捷地純化外泌體等細(xì)胞外囊泡。通過應(yīng)用以鈣離子依賴方式與細(xì)胞外囊泡表面的磷脂酰si氨酸（PS）結(jié)合的Tim4，并使用螯合劑實現(xiàn)完整的細(xì)胞外囊泡純化。
特點
● 通過新型親和法（PS親和法）可獲得高純度的細(xì)胞外囊泡
● 與傳統(tǒng)的超速離心法相比，可獲得更高回收量和純度的外泌體
● 可獲得完整的外泌體，應(yīng)用廣泛
● 磁珠操作簡便，可處理多個樣品
操作流程
試劑盒組成
2 tests | 10tests | |
Biotin Capture Magnetic Beads | 120 μL | 600 μL |
Biotin-labeled Exosome Capture | 20 μL | 100 μL |
Exosome Immobilizing / Washing Buffer (10×) | 5 mL | 25 mL |
Exosome Binding Enhancer (500×) | 300 μL | 1500 μL |
Exosome Elution Buffer (10×) | 300 μL | 1500 μL |
Reaction Tubes | 4支 | 22支 |
◆PS親和法提取純化外泌體的應(yīng)用數(shù)據(jù)合集
使用PS親和法提取和純化外泌體的性能數(shù)據(jù)。
1. 從培養(yǎng)上清樣品純化的細(xì)胞外囊泡性能數(shù)據(jù)
2. 從血清、血漿、尿液樣品純化的細(xì)胞外囊泡性能數(shù)據(jù)
3. 與傳統(tǒng)沉淀法的性能比較
4. 健康人血清來源外泌體的miRNA和mRNA的回收量比較
5. 外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
6. 使用Protein Assay BCA Kit定量外泌體的蛋白濃度
7. 外泌體的標(biāo)記和Hela細(xì)胞導(dǎo)入實驗
1. 從培養(yǎng)上清樣品純化的細(xì)胞外囊泡的性能數(shù)據(jù)
使用透射電子顯微鏡對PS親和法和超速離心法分離的外泌體進(jìn)行分析。
①本試劑盒純化的樣品
樣品：COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清10 mL
粒子數(shù)：3.69×1010 particles/mL
②超速離心法純化的樣品
樣品：COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清10 mL
粒子數(shù)：1.68×1010 particles/mL
與超速離心法相比，PS親和法分離的外泌體可觀察到多約100 nm的囊泡，且雜質(zhì)少。
2. 從血清、血漿、尿液樣品純化的細(xì)胞外囊泡的性能數(shù)據(jù)
從人血清提取的外泌體回收量比較
使用本試劑盒、超速離心法和表面抗原抗體親和法從1 mL的人血清樣品中提取外泌體，并進(jìn)行Western blot（抗CD9抗體和抗CD63 抗體）。
| 泳道1：超速離心法 泳道2：PS親和法 泳道3：A公司外泌體提取試劑盒（CD9） 泳道4：A公司外泌體提取試劑盒（CD63） 泳道5：A公司外泌體提取試劑盒（CD81） 泳道6：A公司外泌體提取試劑盒（CD9、CD63、CD81和EpCAM抗體磁珠混合物） |
WB數(shù)據(jù)：每個樣本結(jié)果對應(yīng)150 μL的血清樣品。從100 μL提取物中取出15 μL，添加５μL的 4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。
結(jié)果：與超速離心法和抗體親和法相比，PS親和法的外泌體回收率更高。
從人EDTA血漿樣品中分離外泌體
分別從１mL的EDTA血漿、EDTA血漿（超濾更換緩沖液）、人血清中樣品中提取外泌體，并進(jìn)行Western blot （抗 Flotillin2 抗體）。
| 泳道1：EDTA血漿 泳道2：EDTA血漿（超濾更換緩沖液） 泳道3：血清 檢測抗體：抗Flotillin-2小鼠單抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience 使用樣品量：各１mL WB數(shù)據(jù)：每個樣本結(jié)果對應(yīng)150 μL血清樣品。從100 μL提取物中取出15 μL，添加５μL的4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。 結(jié)果：通過超濾更換緩沖液后，可以更高效地回收外泌體。 |
從人尿液樣品中分離的外泌體回收量比較
使用本試劑盒、聚合物沉淀法和超速離心法從1 mL尿液樣品中提取外泌體，并進(jìn)行Western blot。
標(biāo)記蛋白回收量比較
| 泳道1：聚合物沉淀法 泳道2：超速離心法 泳道3：PS親和法
檢測抗體：抗 CD9 兔多抗（System Biosciences） 使用樣品量：各１mL WB數(shù)據(jù)：每個樣本結(jié)果對應(yīng)150 μL尿液樣品。從100 μL提取物中取出15 μL，添加５μL的 4×SDS 樣品緩沖液，全部上樣。 |
|
|
|
Size Distribution Mean: 176 +/- 1.6 nm | Size Distribution Mean: 191 +/- 9.4 nm | Size Distribution Mean: 107 +/- 1.2 nm |
結(jié)果：從尿液樣品中也可以高純度提取外泌體。
3. 與傳統(tǒng)沉淀法的性能比較
分別用本試劑盒、超速離心法和聚合物沉淀法從K562（人慢性骨髓性白血?。┘?xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)上清或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）提取外泌體，比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。
PS 親和法：按照試劑盒的Protocol（反應(yīng)時間：3 h），從1 mL經(jīng)離心處理（10,000×g，30 min）的 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）中提取外泌體。
超速離心法：將10 mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30 min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）進(jìn)行超離（110,000×g，70 min），用TBS緩沖液重懸沉淀物后，再進(jìn)行超離（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。
聚合物沉淀法：從1 mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30 min）的 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）中，按照市售的A公司產(chǎn)品的操作說明（靜置時間：過夜）提取外泌體。
比較提取的外泌體的電子顯微鏡分析結(jié)果和納米粒子追蹤（NTA）分析結(jié)果
分別用本試劑盒、超速離心法和聚合物沉淀法從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清提取外泌體，用NTA LM-10 檢測外泌體的粒子直徑。另外，用最終濃度為２%的多聚甲醛固定提取到的外泌體（２~4×1010 particles），使用電子顯微鏡進(jìn)行分析。
電子顯微鏡圖像 數(shù)據(jù)提供：金澤大學(xué) 醫(yī)學(xué)系 華山教授、大阪大學(xué) iFReC 中井先生
結(jié)果：MagCapture™（PS親和法）可提取約100 nm 的粒子，在電子顯微鏡中也可以確認(rèn)到大量的細(xì)胞外囊泡。
K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）提取的外泌體回收量和純度的比較
使用本試劑盒、超速離心法和聚合物沉淀法從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）提取外泌體并進(jìn)行電泳，再使用銀染色和 WB 法（抗CD63抗體、抗Flotilin-2抗體和抗Lamp-1 抗體）進(jìn)行檢測。
結(jié)果：銀染色結(jié)果顯示，與MagCapture™（PS親和法）相比，超速離心法和聚合物沉淀法可提取更多外泌體。但是，WB法顯示，只有MagCapture™ 外泌體提取試劑盒可檢測外泌體標(biāo)記蛋白條帶。
由此可知，MagCapture™ 外泌體提取試劑盒可提取更高純度的外泌體。
K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（10% FBS添加培養(yǎng)基）提取外泌體的回收量和純度的比較
使用本試劑盒 、超速離心法和聚合物沉淀法，從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（10%去外泌體FBS 添加培養(yǎng)基）提取樣品進(jìn)行電泳，再用銀染法和WB法（抗CD63抗體、抗Flotilin-2抗體和抗Lamp-1 抗體）進(jìn)行檢測。同時，對外泌體提取片段進(jìn)行質(zhì)譜分析，比較所有分析的多肽中K562細(xì)胞來源的人多肽的比例（添加至培養(yǎng)基的FBS來源牛蛋白聚集體混入，會導(dǎo)致人來源多肽比例下降）。
質(zhì)譜分析 數(shù)據(jù)提供：金澤大學(xué) 醫(yī)學(xué)系 華山教授、大阪大學(xué) iFReC 中井先生
結(jié)果：使用MagCapture™（PS親和法）可從FBS培養(yǎng)基中提取高純度外泌體，因此在低背景時也可進(jìn)行質(zhì)譜檢測。
4. 健康人血清來源外泌體的miRNA和mRNA的回收量比較
比較從不同方法制備的外泌體中microRNA和mRNA的回收量
使用超離法和PS親和法從健康人血清中分離外泌體后，再使用microRNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）提取RNA。通過定量PCR法比較microRNA量（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）和mRNA量（GAPDH, PIK3CB）的Ct 值。
結(jié)果：與超離法相比，PS親和法提取外泌體中的microRNA和mRNA的效率更高。
使用PS親和法從健康人血清中分離外泌體，再使用 microRNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）或使用AGPC 法提取RNA。通過定量PCR法比較microRNA量（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）和mRNA量（GAPDH, PIK3CB）的Ct值。
結(jié)果：與AGPC法相比，使用microRNA提取試劑盒提取外泌體中的microRNA和mRNA的效率更高。
5. 外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
實驗內(nèi)容和結(jié)果
分別使用PS親和法、超離法和聚合物沉淀法，從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（添加10%去外泌體FBS的培養(yǎng)基）中純化外泌體。純化的樣品通過 10% SDS-PAGE電泳分離，切下全部蛋白條帶。然后進(jìn)行膠內(nèi)消化，用液相色譜質(zhì)譜（LC-MS）鑒定蛋白。比較上述三種方法純化的外泌 體（n=3）中檢測蛋白的成對相關(guān)性。
鑒定的蛋白含量qian10的蛋白
白色柱：外泌體來源人蛋白
灰色柱：牛血清來源牛蛋白
紅 色：外泌體標(biāo)記蛋白
樣品：K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（10%已去除外泌體的培養(yǎng)基）
PS親和法 | 超離心 | 聚合物沉淀法 | |
1 | 71 kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein) | DNA依賴蛋白激酶催化亞基基因 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit) | 補(bǔ)體C3 (Complement C3) |
2 | 膜聯(lián)蛋白A6 (Annexin A6) | 鐵轉(zhuǎn)蛋白受體１ (Transferrin receptor protein1) | α2-巨球蛋 (Alpha-2-macroglobulin) |
3 | 鐵轉(zhuǎn)蛋白受體１ (Transferrin receptor protein1) | 血清白蛋白 (Serum albumin) | 纖連蛋白 (Fibronectin) |
4 | V-ATP酶A亞基 (V-type proton ATpase catalytic subunit A) | ATP依賴RNA解旋酶 (ATP-dependent RNA helicase A) | 血清白蛋白 (Serum albumin) |
5 | 浮艦蛋白-2 (Flotillin-2) | 微管蛋白β5 (Tubulin beta-5 chain) | 血小板反應(yīng)蛋白-1 (Thrombospondin-1) |
6 | 程序性細(xì)胞死亡６互作蛋白 (Programmed cell death 6-interacting protein) | 71 kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71 kDa protein) | 補(bǔ)體C4 (Complement C4) |
7 | 細(xì)胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain ) | 脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase) | α-1抗蛋白酶 (Alpha-1-antiproteinase) |
8 | 膜聯(lián)蛋白A1 (Annexin A1) | 細(xì)胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain) | 載脂蛋白-β-100 (Apolipoprotein-β-100) |
9 | 220kDa激酶D相互作用底物 (Kinase D-interacting substrate of 220kDa) | U5小核核糖核蛋白的解旋酶 (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase) | 胎兒血紅蛋白亞單位 (Hemoglobin fetal subunit beta) |
10 | 膜聯(lián)蛋白A2 (Annexin A2) | β4微管蛋白 (Tubulin beta-4B chain) | β5微管蛋白 (Tubulin beta-5 chain) |
結(jié)果：聚合物沉淀法中混入了牛血清來源蛋白，與之相比，PS親和法檢測出了更多的標(biāo)記蛋白。
| 樣品：K562細(xì)胞培養(yǎng)上清(10% 去外泌體FBS培養(yǎng)基)
參考文獻(xiàn)：Sci Rep. 2016 Sep 23;6:33935. Nakai W et al. |
同種方法的相關(guān)性：PS親和法和聚合物法較高，超離法稍低，
不同方法的相關(guān)性：較低，各種提取方法獲得的外泌體亞群可能不同。
6. 使用Protein Assay BCA Kit定量外泌體的蛋白濃度
Protein Assay BCA Kit 是使用二辛可寧酸（BCA）定量檢測溶液中蛋白質(zhì)濃度的試劑盒，是蛋白質(zhì)定量檢測法中常用的方法。其原理為，堿性條件下的蛋白質(zhì)Cu2+ 離子被還原為Cu+。Cu+與BCA形成絡(luò)合物，產(chǎn)生紫色螯合物，紫色螯合物顏色與蛋白質(zhì)濃度相關(guān)，因此通過測定562 nm 處的吸光度，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，即可定量溶液中的蛋白質(zhì)濃度。
使用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取外泌體，并通過Protein Assay BCA Kit高靈敏檢測外泌體中的蛋白質(zhì)濃度。
實驗內(nèi)容及結(jié)果
將MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）提取的25 μL外泌體溶液分注于96孔板中，添加200 μL的Protein Assay BCA Kit 中試劑Ａ和試劑Ｂ的混合液。然后60℃孵育30 min，檢測560 nm 處的吸光度（圖1）。結(jié)果表明，通過 Protein Assay BCA Kit 的高靈敏度檢測，可檢測純化外泌體中的蛋白質(zhì)濃度。
外泌體蛋白質(zhì)濃度非常低，因此BCA檢測時無需稀釋樣品。
①將 BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液按照 250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL 和空白對照，分別每孔 25 μL添加至96 孔板中。
②分別把純化的外泌體和洗脫緩沖液（空白）按照每孔 25 μL添加至96 孔板。
③將200 μL Protein Assay BCA Kit（產(chǎn)品編號：297-73101）的試劑Ａ和試劑Ｂ混合液（Ａ﹕Ｂ=50﹕1）添加至孔板中。
④60℃孵育30 min。
⑤室溫下冷卻孔板。
⑥檢測560 nm處的吸光度。
7. 外泌體的標(biāo)記和Hela細(xì)胞攝入實驗
實驗概要
使用PKH67（Sigma）標(biāo)記 MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）純化的外泌體，確認(rèn)是否可導(dǎo)入Hela 細(xì)胞。
PKH67標(biāo)記外泌體
1. MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）純化外泌體（實驗當(dāng)天從COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化外泌體）。
※ 在步驟6-7的凝膠過濾步驟中，為了減少標(biāo)記樣品的吸附損失，建議向試劑盒附帶的洗脫液中添加EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent來制備樣品。
2. 用BCA Assay和NanoSight檢測樣品的蛋白質(zhì)濃度和粒子濃度。
3. 將外泌體樣品溶液分裝至1.5 mL管中。
※ 本次使用相當(dāng)于3 μg蛋白量的外泌體，請制備標(biāo)記所需的外泌體量。
4. 將2.0 μL的PKH linker 溶解在0.25 mL 的 DiluentC （PKH67試劑盒隨附）中。…4×Dye solution※
※ 請制備標(biāo)記所需的使用量。
5. 添加1/3樣品量的4×Dye solution至樣品中，混合后在室溫中孵育 5-10 min。
6. 根據(jù)隨附的使用說明書用PBS平衡 Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo ：#4484449）。
7. 將100 μL樣品分別添加至上述平衡后的旋轉(zhuǎn)柱※中，750×g離心2 min。
※ 旋轉(zhuǎn)柱的最大添加量為100 μL，因此樣品量超過100μL時請準(zhǔn)備所需支數(shù)。
8. 將外泌體溶液※添加至已經(jīng)接種好Hela細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，24 h后用顯微鏡觀察并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
※ 根據(jù)實驗調(diào)節(jié)外泌體添加量
顯微鏡觀察結(jié)果 | 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果 |
|
|
圖1. PKH67標(biāo)記外泌體的攝入觀察
關(guān)于使用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）分離COLO201來源外泌體樣品（總蛋白量3 μg，粒子數(shù)1×1010個），使用PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit （Sigma）進(jìn)行標(biāo)記后，可在熒光顯微鏡（左）和流式細(xì)胞儀（右）中確認(rèn)到Hela細(xì)胞的攝入。
結(jié)果：在顯微鏡和流式細(xì)胞儀中都能可確認(rèn)PKH67標(biāo)記的外泌體通過胞吞作用被捕獲。此外添加EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent的樣品在去除Dye時，可極大減少凝膠過濾的吸附損失。
◆各樣品的前處理Protocol
本流程是樣品前處理的步驟。想提取外泌體和其他細(xì)胞外囊泡（微泡）時，請按照下述Protocol對樣品進(jìn)行 1,200×g 離心操作※1，如果要提取更高純度的外泌體，則按照下述Protocol對樣品進(jìn)行10,000×g 離心操作※2。
下文是細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清/血漿的前處理方法。其他體液樣品的前處理操作，請參考血清/血漿的Protocol，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
※1 提取外泌體+Large EVs時，請使用1,200xg上清作為純化用樣品。
※2 提取外泌體時，請使用10,000xg上清作為純化用樣品。
※3 提取Large EVs時，將10,000xg 離心所得的沉淀，用TBS重懸后作為樣品。
※4 濃縮步驟是以大規(guī)模(~50 mL)的細(xì)胞培養(yǎng)上清作為純化用樣品，是選擇性的操作步驟。但由于該步驟可提高回收效率，因此請盡可能進(jìn)行該步驟。
※5 EV-Save™ 含有聚合物，因此不建議用作蛋白質(zhì)組學(xué)分析的樣品。
大量或少量樣品時的注意點
大量樣品
從大規(guī)模（~50 mL）的細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化外泌體時，推薦濃縮操作。因其可提高回收效率，，請盡可能進(jìn)行該操作。
少量樣品
樣品體積低于0.5 mL時，使用旋轉(zhuǎn)裝置無法有效混勻Exosome Capture固化磁珠和樣品，因此請根據(jù)需求添加TBS緩沖液，將樣品體積擴(kuò)增至0.5 mL以上。（例：100 ?200 μL → 500 μL）
參考數(shù)據(jù)：外泌體和Large EVs的NTA分析
準(zhǔn)備了1 mL用莫能菌素鈉促進(jìn)外泌體分泌的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清，并從中制備10,000 x g離心后的上清樣品和10,000 x g沉淀樣品（使用1 mL TBS重懸）。
再使用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒從兩個樣品中純化細(xì)胞外囊泡，并進(jìn)行NanoSight LM10分析。
◆Ver.2和舊款的不同
MagCapture™ 外泌體提取試劑盒Ver.2（產(chǎn)品編號：290-84103）は、MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（產(chǎn)品編號：293-77601，舊款）的改良版。
1. 外泌體回收效率提高
→相同操作下，可提取更多的外泌體！
2. 可大幅度縮短操作時間
→1 h即可完成和樣品的親和反應(yīng)?。ㄅf款需要3 h）
3. 改善細(xì)胞毒性
→降低洗脫緩沖液的細(xì)胞毒性
試劑盒 | MagCapture™ 外泌體提取試劑盒Ver.2 | （舊款）MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 |
外泌體提取性能 | 培養(yǎng)上清：■■■■ 血液樣品：■■■■ | 培養(yǎng)上清：■■■ 血液樣品：■■■ |
樣品反應(yīng)時間※1 | 1 h以上 | 3 h以上 |
磁珠可再利用次數(shù)※2 | 5次 | 5次 |
洗脫緩沖液的細(xì)胞毒性 | 低※3 | 因細(xì)胞種類不同 |
※1 因樣品體積而異。
※2 使用總次數(shù)設(shè)定為5次，包括第一次使用1次，重復(fù)使用4次。提取樣品的來源不同，考慮污染風(fēng)險時，推薦使用新調(diào)配的磁珠。
※3 請勿更換洗脫樣品的緩沖液，可用于In Vitro和In Vivo的給藥實驗。洗脫緩沖液的EDTA出現(xiàn)問題時，需要更換緩沖液。
外泌體回收率的比較（血清和血漿）
外泌體回收率的比較（間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）培養(yǎng)上清）
純化外泌體的細(xì)胞毒性試驗
1. 外泌體的回收率比較（血清和血漿）
使用MagCapture™外泌體提取試劑盒Ver.2（產(chǎn)品編號：290-84103）和舊款試劑盒從各種人血液樣品中分離純化外泌體（EV）。對獲得的外泌體，
①使用PS Capture™外泌體ELISA試劑盒比較EV標(biāo)志物
②通過Western blot比較EV標(biāo)志物
③通過NTA進(jìn)行粒子數(shù)測定
再將試劑盒附帶的洗脫緩沖液按照常規(guī)的Protocol稀釋成“1x Elution buffer（1xEB）"，并和5倍稀釋的“2xElution buffer（2xEB）"進(jìn)行比較。
結(jié)果顯示，Ver.2試劑盒表現(xiàn)出與舊款試劑盒相當(dāng)或更優(yōu)的性能。特別是使用2xElution Buffer時，血漿樣品的回收效率顯著提升。
①使用PS Capture™外泌體ELISA試劑盒比較EV標(biāo)志物
②通過Western blot比較EV標(biāo)志物
檢測抗體：
抗CD9，大鼠單克隆抗體（77B）（產(chǎn)品編號： 019-28173）
抗CD63，單克隆抗體（3-13）（產(chǎn)品編號：012-27063）
抗Flotillin2，單克隆抗體（BD Biosciences）
2. 外泌體回收率比較（間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）培養(yǎng)上清）
使用MagCapture™外泌體提取試劑盒Ver.2（產(chǎn)品編號：290-84103）和舊款試劑盒從MSC培養(yǎng)上清中提取純化外泌體（EV）。對獲得的外泌體，
①使用PS Capture™外泌體ELISA試劑盒比較EV標(biāo)志物
②通過Western blot比較EV標(biāo)志物
③通過NTA進(jìn)行粒子數(shù)測定
結(jié)果顯示，舊款試劑盒相比Ver.2試劑盒回收效率更高。
①使用PS Capture™外泌體ELISA試劑盒比較EV標(biāo)志物
②通過Western blot比較EV標(biāo)志物
3. 純化外泌體的細(xì)胞毒性試驗
分別使用舊款試劑盒和Ver.2試劑盒從COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離和純化EV，再將等量的洗脫樣品和對照洗脫緩沖液添加至提前接種的人正常成纖維細(xì)胞中，48 h后檢測細(xì)胞形態(tài)變化。
結(jié)果顯示，舊款試劑盒在添加Elution buffer和純化外泌體48 h后，出現(xiàn)了細(xì)胞死亡現(xiàn)象，而使用Ver.2試劑盒時未觀察到顯著的細(xì)胞死亡。Ver.2試劑盒改善了舊款試劑盒存在的細(xì)胞毒性問題，因此無需更換Elution buffer即可用于In Vitro及In Vivo給藥實驗。
※ 若Elution buffer的EDTA出現(xiàn)問題時，需要更換緩沖液。
點擊此處查看相關(guān)視頻：MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS Ver.2
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 294-84101 | MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2 MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS Ver.2 | 2次用 | 基因研究用 | |
| 290-84103 | MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2 MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS Ver.2 | 10次用 | 基因研究用 |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 290-80301 | PS Capture(TM) Exosome Isolation Resin Kit PS Capture™外泌體提取樹脂試劑盒 | 1 Kit | 基因研究用 | - |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 297-79201 | PS Capture(TM) Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD) PS Capture™外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 298-80601 | PS Capture(TM) Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) PS Capture™外泌體ELISA Kit （鏈霉親和素HRP） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 296-83701 | CD9-Capture Human Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) CD9-Capture 人外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 290-83601 | CD63-Capture Human Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) CD63-Capture 人外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 292-83801 | CD81-Capture Human Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) CD81-Capture 人外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 297-79701 | PS Capture(TM) Exosome Flow Cytometry Kit PS Capture™外泌體流式試劑盒 | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 012-27063 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 抗CD63單抗（3-13） | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 014-27643 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Fluorescein Conjugated 抗CD63，單克隆抗體（3-13），熒光素結(jié)合 | 100 tests | 免疫化學(xué)用 | - |
| 019-27713 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Biotin Conjugated 抗CD63單克隆抗體（3-13），sheng物素偶聯(lián) | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 011-27751 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Red Fluorochrome(635) Conjugated 抗CD63單克隆抗體（3-13），紅色熒光染料（635）偶聯(lián) | 25 tests | 免疫化學(xué)用 | - |
| 017-27753 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Red Fluorochrome(635) Conjugated 抗CD63單克隆抗體（3-13），紅色熒光染料（635）偶聯(lián) | 100 tests | 免疫化學(xué)用 | - |
| 014-27763 | Anti CD9, Monoclonal Antibody (1K) 抗CD9單克隆抗體（1K） | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 011-27773 | Anti CD81, Monoclonal Antibody (17B1) 抗CD81單克隆抗體（17B1） | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 013-27951 | Anti CD9, Rat Monoclonal Antibody (30B) , Biotin Conjugated 抗CD9，大鼠單克隆抗體（30B），sheng物素標(biāo)記 | 20 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 019-27953 | Anti CD9, Rat Monoclonal Antibody (30B) , Biotin Conjugated 抗CD9，大鼠單克隆抗體（30B），sheng物素標(biāo)記 | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 058-09261 | EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent EV-Save™ 細(xì)胞外囊泡保存穩(wěn)定劑（超濾用） | 1 mL | 基因研究用 | - |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 081-10261 | Human TIM4/Human Fc Chimera, recombinant 人Tim4/人Fc嵌合體，重組 | 100 μg | 基因研究用 | - |
| 137-18511 | Mouse TIM4/Human Fc Chimera, recombinant 鼠標(biāo)TIM4/人Fc嵌合體，重組 | 100 μg | 基因研究用 | - |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 299-36421 | MAGNET STAND MagCapture系列磁珠捕獲用磁力架 | 1個 | - | - |
技術(shù)文章
上一篇
