以外泌體為代表的細胞外囊泡(EV: Extracellular Vesicles)是由細胞釋放的脂質(zhì)雙分子層微囊泡，內(nèi)含核酸、蛋白和脂質(zhì)等。作為生物體內(nèi)細胞間的通信媒介，外泌體相關的研究成為免疫、癌癥、神經(jīng)和代謝等多個領域的研究熱點。

EV的應用領域廣泛，有望應用于治療藥物、生物標志物和藥物遞送系統(tǒng) (DDS)。尤其是間充質(zhì)干細胞(MSC: Mesenchymal stem cell)分泌的EV具有抗炎、抗纖維化和組織修復等作用^1），除醫(yī)療領域外，在化妝品和食品等領域也備受關注。

EV的實際應用需要能夠高效且大規(guī)模分離和純化高純度EV的技術。富士膠片和光采用與金澤大學醫(yī)學系免疫學的華山教授共同開發(fā)的分離和純化技術“PS親和法"^2），開發(fā)了用于大規(guī)模純化EV的MassivEV™ EV Purification Column PS（MassivEV™ 細胞外囊泡（EV）純化分離柱 PS）。配合使用專用的緩沖液MassivEV™ Purification Buffer Set（MassivEV™ 細胞外囊泡（EV）純化緩沖液套裝），可從支持規(guī)模放大的細胞培養(yǎng)上清中簡易分離和純化EV。

◆產(chǎn)品概要

MassivEV™ EV Purification Column PS和MassivEV™ Purification Buffer Set是用于從大規(guī)格細胞培養(yǎng)上清中分離和純化外泌體等細胞外囊泡（EV）的分離柱和專用緩沖液。采用與EV膜表面的磷酯酰si氨酸（PS）鈣離子依賴性結合Tim4的“PS親和法"*，可簡易純化高純度EV。

*利用與EV膜成分的磷酯酰si氨酸（PS）特異性結合Tim4（(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4)）的純化方法。即利用與PS鈣離子依賴性結合Tim4的性質(zhì)，在鈣離子存在下，固定在載體上的Tim4可捕獲樣品中的EV。通過清洗去除雜質(zhì)后，加入EV Elution Buffer（螯合劑），低損傷狀態(tài)下從載體上的Tim4的洗脫和純化EV的方法。

◆特點

● 可從大規(guī)格（10 mL至公升級別規(guī)格）細胞培養(yǎng)上清中高效分離和純化高純度EV

● 無需切向流過濾（TFF）系統(tǒng)等昂貴設備　※只需一個蠕動泵

表1 從200 mL間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清中分離和純化EV的對比（富士膠片和光評估）

※AEX: 陰離子交換色譜法; SEC:尺寸排阻色譜法

<參考> 一只小鼠的EV建議給藥量^3-5）：1.0×10⁹ particles/mouse

◆適應性

細胞培養(yǎng)上清（MSC等）：10 mL至公升級別規(guī)格

※ 從10 mL以下的細胞培養(yǎng)上清中分離EV時，請使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2（產(chǎn)品編號：290-84103）

◆處理樣品量

※1 MSC細胞培養(yǎng)上清中一次純化可處理的大概樣品量。樣品處理量因細胞培養(yǎng)上清中所含的EV粒子數(shù)而異。處理同一樣品時，可重復使用分離柱，已確認最多可使用五次（初次使用1次、重復使用4次）。

※2 使用MSC來源EV的研究結果。可能因細胞種類等條件而異。

◆原理

PS親和法利用與EV膜表面的磷酯酰si氨酸（PS）特異性結合的Tim4，是富士膠片和光開發(fā)的EV分離方法。

PS-Tim4結合的高特異性配合螯合劑的溫和洗脫，可使EV在完整狀態(tài)下高純度分離。

◆實驗方案

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◆數(shù)據(jù)

性能數(shù)據(jù)

與傳統(tǒng)方法對比

在增殖培養(yǎng)基（MSCulture™/ 10% FBS)及EV生產(chǎn)培養(yǎng)基（EV-Up™）中培養(yǎng)骨髓來源的MSC，回收細胞培養(yǎng)上清后，使用0.22 μm過濾器過濾。取200 mL經(jīng)過濾處理的細胞培養(yǎng)上清用作樣品，采用以下4種方法進行分離和純化。純化后的EV溶液分別使用Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)和ELISA進行分析。

<分離方法>

MassivEV™   MassivEV™ EV Purification Column PS / MassivEV™ Purification Buffer Set (本產(chǎn)品, PS親和法)

TFF                僅切向流過濾（500 kDa）

TFF+AEX      切向流過濾（500 kDa）＋陰離子交換色譜法

TFF+SEC       切向流過濾（500 kDa）＋尺寸排阻色譜法

（1）使用NTA 進行粒子分析

【結果】

與TFF相比，MassivEV™ 純化得到的粒子數(shù)量少，但與 TFF+AEX 或 TFF+SEC 相比，MassivEV™ 純化得到的粒子數(shù)量更多

（2）使用CD63 ELISA和CD81 ELISA的EV回收率比較（n=3）

【結果】

相比傳統(tǒng)方法，使用MassivEV™ 的EV回收率更高。

（3）顆粒蛋白比

蛋白質(zhì)與顆粒的比例可用于指示 EV的純度 ^6）。收集的EV溶液中總蛋白含量可以用BCA方法測定，顆粒數(shù)可以用NTA測定。然后，比較每 1 μg 蛋白質(zhì)所含有的顆粒數(shù)。

【結果】

MassivEV方法獲得的每 1 μg 蛋白質(zhì)所含有的顆粒數(shù)是高于傳統(tǒng)方法，也就說明MassivEV方法可以回收純度更高的外泌體。

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