無熒光性新型SHG成像用染料

Ap3, SHG成像染料

Ap3是一種無熒光性SHG染料，在SHG信號成像中不會發(fā)出障礙性熒光。它與常規(guī)的熒光性膜染色染料不同，可以只觀察細胞膜的信號，因此能夠用于分析細胞膜的準確位置。另外，由于SHG信號強度和膜電位相關，因此還能用于膜電位的成像。

※ 本產(chǎn)品僅供科研用，不可作其他用途。

※ 本產(chǎn)品基于慶應義塾大學 醫(yī)學部藥理學教室以及筑波大學 數(shù)理物質(zhì)系（學際物質(zhì)科學研究中心）的研究成果，由funakoshi進行商品化并銷售。

※ Nuriya M.,?et al, Nat. Commun.,?7:11557 (2016).

※ 慶應義塾大學醫(yī)學部 藥理學教室 塗谷老師的相關采訪文章，請點擊此處。

使用SHG專用染料對細胞膜現(xiàn)象進行成像

利用雙光子現(xiàn)象之二次諧波產(chǎn)生（Second Harmonic Generation: SHG）

在顯微鏡下測量細胞膜形態(tài)和變化

慶應義塾大學 醫(yī)學部藥理學教室 塗谷睦生 老師

【背景】

細胞膜分隔細胞內(nèi)外，可以作為在其周邊產(chǎn)生的電信號和化學信息的傳遞場所，因此在細胞間和細胞內(nèi)的信息傳遞中起著十分重要的作用。但是，由于其結(jié)構(gòu)的精細和復雜性等，難以進行生理學上的分析。研究發(fā)現(xiàn)，對細胞膜具有高親和力的染料在細胞膜中會發(fā)出強烈的SHG信號，由于該信號會根據(jù)膜電位而變化，因此研究認為，SHG成像在細胞膜的標記及其電位變化的分析等方面非常有效。

【無熒光性SHG專用染料Ap3】

Ap3是為了SHG成像而開發(fā)和合成的一種新型的無熒光性SHG專用染料，使用這種染料可實現(xiàn)觀察其他熒光染料的同時觀測。利用這一點，使用Ap3進行SHG成像可以觀察到響應神經(jīng)活動引起的膜電位變化，同時通過鈣敏感性染料的熒光成像，還可以觀察到膜附近鈣濃度的變化。研究表明，使用Ap3進行的成像，由于光照射引起的信號衰減和細胞毒性非常低。因此利用Ap3能夠可視化細胞膜，捕捉膜電位的變化，還可能同時對熒光蛋白的動態(tài)和報告熒光染料的信號變化進行長時間成像。因而使用Ap3對腦細胞、包括肌細胞在內(nèi)的其他興奮性細胞的生理學分析，或使用各種系統(tǒng)的離子通道的功能分析等的應用方面?zhèn)涫芷诖?/span>

【展望】

除上述以外，SHG成像還可以對細胞膜的損傷和脂質(zhì)成分，以及核酸或蛋白等生物分子的結(jié)構(gòu)變化等多種生命現(xiàn)象進行高靈敏度檢測。利用具有這種特殊能力的普通多光子顯微鏡系統(tǒng)，即可輕松地進行SHG成像，而且通過擴展專用染料的應用性，相信SHG成像作為生命科學領域研究中的新型工具會有更進一步的發(fā)展。

◆特點

●　Ap3是SHG成像的專用染料。除 SHG信號外，不會發(fā)出熒光

●　Ap3無熒光性， SHG成像的同時還能進行鈣成像等熒光性成像的多模式成像

●　Ap3是一種光穩(wěn)定性高的化合物

●　Ap3具有極低的光毒性，對細胞的損傷小

●　推薦光源：鈦藍寶石激光（波長標準：950 nm）

※ 在SHG成像中，需要雙光子激發(fā)顯微鏡、SHG信號用濾光片（例如465-485 nm的帶通濾光片）

※ 在SHG成像的觀察中，物鏡的另一側(cè)（正置顯微鏡時為下方）需要檢測系統(tǒng)。另外，在檢測系統(tǒng)一側(cè)建議使用具有光電倍增管（PMT）的顯微鏡。

◆操作方法要點

1. 在玻璃底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞；

2. 向細胞中添加終濃度為20 μM的Ap3溶液；

3. 使用雙光子激發(fā)顯微鏡進行觀察。

◆應用實例1

■　Ap3的SHG信號和無熒光性

950 nm激光照射時，通過Ap3可觀察到 SHG 信號，但未觀察到熒光信號。

■　腦切片中SHG成像的膜電位變化

A：電壓固定時SHG信號的膜電位敏感性

B：動作電位依賴性SHG信號變化（左）和通過膜片鉗測量的電位變化（右）

Nuriya M.,?et al, Nat. Commun.,?7:11557 (2016).

■　同時測量腦切片中SHG成像的膜電位變化和熒光成像的鈣濃度

在腦切片中反復施加動作電位時（左；比例尺20 mV，5 s），觀察Ap3的SHG信號和熒光性鈣檢測試劑Rhod-2的雙光子熒光信號（TPF）（右）。在成像中同時測量的膜電位變化和鈣濃度變化。

Nuriya M.,?et al, Nat. Commun.,?7:11557 (2016).

◆應用實例2

■　比較多模式雙光子顯微鏡下的細胞膜選擇性SHG成像和細胞膜熒光成像

用Ap3對表達細胞膜觀察用膜錨定GFP的細胞進行染色，同時可視化在950 nm飛秒激光照射下GFP的雙光子熒光（TPF，綠色）和Ap3的SHG（洋紅色）信號。

由于GFP信號不僅從細胞膜，還會從囊泡等許多細胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)中發(fā)出強烈的熒光，因此難以準確地識別出細胞膜的位置。與之相對的，Ap3的 SHG 信號只能從細胞膜發(fā)出，從而可以實現(xiàn)細胞膜的選擇性成像和位點的準確識別。

Mizuguchi T.,?et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式雙光子顯微鏡下細胞膜正下方的囊泡動態(tài)和肌動蛋白

在表達GFP標記肌動蛋白的細胞中，分別用紅色熒光標記Dextran染色胞吞后的囊泡，用Ap3染色細胞膜，同時利用多模式雙光子顯微鏡進行可視化。

Ap3的SHG信號具有細胞膜特異性，而且可以與熒光信號分離，因此能夠通過Ap3的SHG信號準確識別細胞膜的位置，從而準確地測量從細胞膜到肌動蛋白骨架的距離。

Mizuguchi T.,?et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式雙光子顯微鏡下質(zhì)膜正下方的囊泡動態(tài)和微管蛋白

在經(jīng)過微管蛋白可視化試劑染色的細胞中，分別用紅色熒光標記Dextran標記胞吞后的囊泡，用Ap3標記細胞膜，利用多模式雙光子顯微鏡進行可視化。

Ap3的SHG信號具有細胞膜特異性，而且可以與熒光信號分離，因此能夠通過Ap3的SHG信號準確識別細胞膜的位置，而且可以測量從細胞膜到微管，以及細胞膜正下方囊泡移動的準確距離。

Mizuguchi T.,?et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

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